F s Kerngene der zirkadianen Uhr (CC-Gene): Weder die Ernährung noch der mikrobielle Status des Darms beeinflussen den zirkadianen Rhythmus und die Amplitude der Kern-CC-Gene in Schleimhautabstrichen

Antimikrobielle Peptid-Transkriptwerte: rc-SPF-Mäuse hatten signifikant erhöhte Transkriptwerte in bestimmten ZTs, insbesondere in Mitgliedern der REG3-Familie, einschließlich Reg3g und Reg3b, ohne signifikante Unterschiede bei anderen, wie z. B. LYZ1

Übersetzungsniveau: (Methode: Immunfärbung): Ein ähnliches tageszeitliches Variationsmuster von REG3g wurde in der rc-SPF-Gruppe, jedoch nicht in der SPF-hf-Gruppe beobachtet, während es durch Immunfärbung von LYZ1 keinen offensichtlichen Unterschied in den Expressionsniveaus oder Oszillationsniveaus gab

Methoden: Western Blot: Ernährungs- und zt(zeit)-abhängige REG3γ-Oszillationen entdeckt

Nur RC-gefütterte Mäuse 1–8 zeigten eine ZT-abhängige Reg3g-Expression, wohingegen es keinen Unterschied in der Krypta-Expression von ZT2 und 10 bei RC- oder HF-gefütterten Mäusen gab (Abbildung 1F).

1. Unabhängig vom mikrobiellen Status oder der Ernährung ist das zentrale CC-Gennetzwerk stabil; 2. Der zirkadiane Rhythmus der Reg3g-Expression des Wirts in Zottenepithelzellen wird durch das Vorhandensein von Darmmikroben, einschließlich durch die Nahrung ausgewählter Mikroben, gesteuert

HF erhöhte die relative Häufigkeit der zum Stamm Firmicutes gehörenden Arten signifikant und verringerte den Stamm Bacteroidetes. Methoden: Die 16SrRNA-Gen-Amplikonsequenzierung und die quantitative Analyse der mikrobiellen Ökologie (QIIME) wurden regelmäßig am Inhalt des distalen Ileums durchgeführt.

Die Beta-Diversitätsanalyse mit Bray-Curtis ergab signifikante Unterschiede zwischen RC- und HF-Mikrobengemeinschaften (Tabelle S3).

Obwohl die Kopienzahl des 16SrRNA-Gens bei RC- und HF-gefütterten Mäusen ähnliche Amplituden aufwies, induzierte HF eine Phasenverschiebung im Vergleich zu RC (Abb. 2C).

Es wurden signifikante OTU-Unterschiede zwischen RC- und HF-gefütterten Mäusen beobachtet (Abb. 2D), wobei HF Clostridiales signifikant erhöhte und Bacteroidetes im Vergleich zu RC verringerte (Tabelle S2).

Der Prozentsatz der durch eJTK identifizierten oszillierenden und nicht oszillierenden OTUs (Kreisdiagramm) und die Anzahl der eindeutigen und gemeinsam genutzten oszillierenden OTUs (Venn-Diagramm). 15 % der ilealen Taxa schwankten unter RC und wurden durch HF signifikant reduziert. Im Lumeninhalt von RC-gefütterten Mäusen wurden insgesamt 81 einzigartige oszillierende OTUs beobachtet, während bei HF-gefütterten Mäusen nur zwei oszillatorische OTUs vorhanden waren, die sich in RC und HF überlappten (Tabelle S4).

Unter HF-Bedingungen fehlten den Gattungen zugeordnete Oszillationen, die Gesamthäufigkeit nahm ab oder die Oszillation ging im Vergleich zu RC-OTUs verloren (Abbildung 2F).

1. HF verändert den mikrobiellen Reichtum des distalen Ileums erheblich 2. HF hat eine Gruppe von Oszillationsgruppen ausgewählt, die relativ einzigartig für RC sind. 3. Trotz des allgemeinen Rückgangs der HF-Oszillations-OTUs

Die Ergebnisse der Pearson-Korrelationsanalyse zeigten, dass nur 3 OTUs im Lumeninhalt von RC- und HF-gefütterten Mäusen signifikant mit der Expression von Reg3γ korrelierten. Es gab eine positive Korrelation zwischen der Expression von Lactobacillus-OTUs und Reg3g, während die Expression von OTUs der Familien Clostridiaceae und Peptidetococcaceae negativ korrelierte (Abb. 2G).

Obwohl mit Reg3g negativ korrelierte OTUs bei RC- oder HF-gefütterten Mäusen nicht schwankten, war ihre relative Häufigkeit bei allen ZT im Vergleich zu RC signifikant erhöht (Abb. 2H).

Die relative Häufigkeit von Clostridiaceae, Lactobacilliaceae und Gastrostreptococcus zeigte nahezu die gleichen positiven und negativen Korrelationen mit der Expression von Reg3g (Abb. 2I).

1. Lactobacilliaceae werden durch RC angereichert und weisen Oszillationen auf 2. Die spezifischen OTUs der Milchsäurebakterien korrelieren positiv mit der täglichen Reg3g-Expression des Wirts. 3. Die HF-Fütterung reduziert die mikrobielle Oszillation und fördert die allgemeine Ausbreitung von Clostridiaceae und Gastrostreptococcus, die beide negativ mit der Expression von Reg3g korrelieren.

Bei ZT10 induzierte die 24-stündige Exposition gegenüber Lysat im Ileumlumen von SPF-Mäusen im Vergleich zu HF-Lysat die Expression von Reg3g in enteroiden Zellen von WT-Mäusen.

Methode: Als konditioniertes Medium wurden Lactobacillus rhamnosus GG (LGG, Familie Lactobacilliaceae), anaerobe Magen-Streptokokken (Clostridiaceae P. stomatis) und orogastrische Anaerobier (LGG, Familie Orogastric Streptococcus) verwendet. Ergebnisse: Die 12-stündige Exposition von Enteroiden gegenüber LGG-konditioniertem Medium induzierte die Expression von Reg3γ signifikant (Abbildung 3B).

Wir beobachteten, dass LGG allein die Expression von Reg3g induzierte, P. stomatis allein dagegen nicht. Die gleichzeitige Exposition gegenüber Enterobacteriaceae hemmte die Induktion von Reg3g, selbst in Gegenwart von LGG. Diese Daten deuten darauf hin, dass durch HF selektierte Bakterien unabhängig von der Exposition gegenüber induktionskonditioniertem Medium eine hemmende Wirkung auf die Expression von Reg3g haben.

Zweck: Feststellung, ob LGG oder P. stomatis MyD88-Signalisierung benötigen, um die Expression von Reg3g zu beeinflussen (Quelle) Methoden: Därme von SPFMyD88/oder MyD88/Wurfgeschwistern wurden verschiedenen bakteriell konditionierten Medien ausgesetzt. Ergebnisse: LGG induzierte Reg3g signifikant in MyD88/-, jedoch nicht in MyD88-/-; es gab keine Induktion in P. stomatis-Paaren, unabhängig vom MyD88-Status (Abbildung 3D). Fazit: LGG braucht MyD88

Zweck: Weitere Aufklärung, ob von LGG oder P. stomatis abgeleitete kleine Moleküle die Reg3g-Expression unterschiedlich beeinflussen, Methoden: Konditionierte Medien wurden nach Größe fraktioniert (Abbildung 3E). Ergebnisse: Von LGG abgeleitete kleine Moleküle mit weniger als 3 kDa reichten aus, um die Expression von Reg3g zu induzieren, während P. stomatis eine signifikante Hemmwirkung auf alle Komponenten hatte, die kleine Moleküle mit weniger als 30 kDa enthielten. Schlussfolgerung: Von LGG abgeleitete kleine Moleküle induzieren Reg3g, während von P. stomatis abgeleitete kleine Moleküle die Reg3g-Expression auf myd88-abhängige Weise hemmen.

Zweck und Methoden: Testen, ob die Wärmebehandlung einer konditionierten 3kDa-Lgg-Mediumfraktion ihre Fähigkeit zur Induktion der Reg3g-Expression beeinflusst. Ergebnisse: In enteroiden Zellen von SPF-WT-Mäusen führte die Wärmebehandlung zu einer 30–40 %igen Verringerung der Fähigkeit, Reg3g zu induzieren, verglichen mit unbehandeltem, 3 kDa isoliertem LGG (Abbildung 3F).

1. Von LGG abgeleitete kleine Moleküle sind thermisch instabil 2. Zur Induktion von Reg3g können stammspezifische Verbindungen erforderlich sein

Unterthema

Um die einzigartigen kleinen Moleküle, die von LGG und L. reuteri produziert werden, weiter zu charakterisieren und zu differenzieren, führten wir als nächstes eine Massenspektrometrieanalyse mittels LC-MS/MS bei 3 kDa und wärmebehandelten konditionierten Medien durch (Abbildung 3G). 3kDa Lactobacillus reuteri weist im Vergleich zu unbehandeltem und wärmebehandeltem 3kDa LGG einzigartige Eigenschaften auf

Die Differenz- und Faltungsänderungsanalyse (p1) ergab: 859 einzigartige kleine Molekülunterschiede zwischen 3 kDa unbehandeltem und wärmebehandeltem LGG, während 3 kDa LGG und 3 kDa L. reuteri 1439 einzigartige unterschiedliche Eigenschaften mit einer Überlappung von 149 aufwiesen (Abb. 3H). ).

Das Vulkandiagramm zeigte eine Abnahme der Häufigkeit kleiner Moleküle zwischen unbehandeltem LGG 3 kDa und wärmebehandeltem LGG (7,51–6,88), während 3 kDa LGG einen größeren FC (10,69–9,88) im Vergleich zu 3 kDa L. reuteri aufwies (Abbildung 3I). Dies deutet darauf hin, dass die Unterschiede in den Profilen kleiner Moleküle zwischen LGG und L. reuteri größer sind als die, die nach der Wärmebehandlung von LGG beobachtet wurden.

Die 25 unterschiedlich häufig vorkommenden Moleküle mit dem höchsten positiven und negativen FC-Gehalt im Vergleich zu LGG3kDa sind in Tabelle S5 aufgeführt. Obwohl die Identität vieler Metaboliten unbekannt ist, wurden einige als verzweigtkettige Aminosäuren identifiziert (Tabelle S5, blau hervorgehoben). A

Obwohl es derzeit ungewiss ist, welche spezifischen kleinen Moleküle die Induktion oder Unterdrückung der Reg3g-Expression steuern, deuten diese Daten darauf hin, dass es erhebliche Unterschiede im Reg3g-Expressionsprofil jedes Bakteriums gibt.

Um unsere In-vitro-Ergebnisse zu übersetzen, haben wir einfach assoziierte RCfed-GF-Mäuse mit Milchsäurestämmen, die eine einzigartige Fähigkeit haben, die Reg3g-Expression zu induzieren, und Stämmen, die einzigartig resistent gegen die antimikrobiellen Eigenschaften von REg3g sind, nämlich LGG und Lactobacillus reuteri, (Abbildung 3J) . Die Reg3g-Expression war nur in Ileumschleimhautabschürfungen von LGG-mono-assoziierten Mäusen, die bei ZT10 geerntet wurden (erwartete Spitzenexpression), signifikant erhöht, nicht jedoch in GF-Kontrollen oder L. reuteri-mono-assoziierten Mäusen. Nur LGG-mono-assoziierte Mäuse zeigten Reg3g-Oszillationen, wohingegen bei GF- und L. reuteri-mono-assoziierten Mäusen in allen 3 zt niedrige und konstante Expressionsniveaus beobachtet wurden.

Ergänzende Materialien: LGG-monoassoziierte Mäuse und ihre GF-Gegenstücke wurden mit RC bzw. HF gefüttert. LGG-HF führte 3 und 4 Wochen nach der Assoziation zu einer leichten, aber signifikanten Gewichtszunahme im Vergleich zu LGG-RC (Abb. S3E).

Die Zusammensetzung der Nahrung und spezifische Bakterien beeinflussen Reg3g im distalen Ileum während des Tages direkt, was Veränderungen in den Stoffwechselergebnissen des Wirts entspricht.

Ernährung oder genetischer Hintergrund hatten keinen Einfluss auf die allgemeine und tägliche Expression von CC, was die Unabhängigkeit zwischen dem zentralen CC-Gennetzwerk und Reg3g weiter unterstützt (Abb. S4A; Tabelle S1).

Bei RCReg3g/Maus war die Reg3g-Expression signifikant erhöht und nahm von Tag zu Tag zu und erreichte einen Höhepunkt bei ZT10, wohingegen bei Reg3g/Maus kein Transkript nachgewiesen wurde (Abb. 4A).

Reg3g und andere AMPs sind unabhängig vom Kern-CC, und Reg3g scheint ernährungsbedingte Auswirkungen auf die Expression und Rhythmik von Muc2 zu vermitteln

Reg3g-/-Mäuse waren im Vergleich zu Reg3g/Wurfgeschwistern gleichermaßen anfällig für durch HF-Diät verursachte Fettleibigkeit und zeigten über 4 Wochen einen Anstieg des Körpergewichts um 12 % im Vergleich zu mit RC gefütterten Mäusen (Abbildung 4B).

1. Im Vergleich zu mit rc-gefütterten Reg3g/--Kontrollen zeigten rc-gefütterte Reg3g-/-Mäuse eine deutlich schlechtere Glukosetoleranz, eine langsamere Glukoseclearance und eine größere Fläche unter der Kurve (AUC). 2. Die Blutzucker-Clearance-Rate von HF war unabhängig von der mit RC-gefütterten Reg3g/Maus verringert (Abbildung 4C).

Ergänzende Materialien: Unabhängig vom Genotyp erhöhte HF die relative Häufigkeit von Firmicutes signifikant, mit einer entsprechenden Abnahme der Häufigkeit von Bacteroidetes und einer leichten Veränderung der Häufigkeit von Actinobakterien (Abb. S5A).

Eine Beta-Diversitätsanalyse mithilfe der Bray-Curtis-Distanz zeigte, dass sich die Gemeinschaftszugehörigkeit von HF unabhängig vom Genotyp des Lumeninhalts änderte (Abb. 5A; Tabelle S3).

Signifikante Unterschiede in der Gemeinschaftszugehörigkeit wurden zwischen den Genotypen beobachtet, jedoch nur bei Gabe von RC, was auf einen ernährungsabhängigen Genotypeffekt hinweist (Abb. 5B, linkes Feld), der durch HF abgetragen wurde (Abb. 5B, rechtes Feld).

Die relative Häufigkeit von Lactobacilliaceae war bei mit HF gefütterten Reg3g/-Mäusen im Vergleich zu mit RC gefütterten Reg3g/-Mäusen verringert, wohingegen bei mit RC gefütterten Mäusen Peptidococcaceae und Clostridiaceae unabhängig vom Genotyp verringert waren. .

Die Ernährung verändert das Mikrobiom des distalen Ileums umfassend, mit moderaten und ernährungsabhängigen Auswirkungen von REG3g.

Obwohl sich die Kopienzahl des 16SrRNA-Gens nicht zwischen den Gruppen unterschied, war eine zirkadiane Rhythmik nur bei rc-gefütterten reg3g-/-Mäusen erkennbar (Abb. S5D; Tabelle S1).

Im Vergleich zu allen anderen Taxa wiesen die oszillierenden Taxa die höchste Diversität auf der Ordnungsebene des intraluminalen Inhalts auf (Abb. 6A, linkes Feld; Tabelle S6). Bei Reg3g/Mäusen führte HF im Vergleich zu mit RC gefütterten Kontrollen zu einer Verringerung der oszillierenden Laktobazillen und Clostridien. Bei Reg3g/Maus reduzierte HF jedoch die oszillierenden Bacteroidetes-Ordnungen und erhöhte gleichzeitig die oszillierenden Clostridiales (Abb. 6A, linkes Feld; Tabelle S6). Wir beobachteten, dass Schleimhautkratzer im Verhältnis zum Lumeninhalt einzigartige OTU-Oszillationseigenschaften aufwiesen (Abb. 6A, rechtes Feld; Tabelle S6). Unabhängig vom Genotyp waren die oszillatorischen OTUs von RC im Vergleich zu ihrem intraluminalen Inhalt viel weniger vielfältig (Abb. 6a; Tabelle S6).

Viele oszillierende Lactobacillus-OTUs zeigten unabhängig vom Genotyp eine erhöhte relative Häufigkeit bei mit RC gefütterten Mäusen (Abbildung 6B).