1. Überblick über Protein
Eiweiß
Eine oder mehrere Polypeptidketten, die durch die Kondensation vieler verschiedener Aminosäuren über Amidbindungen (Peptidbindungen) in einer bestimmten Reihenfolge entstehen. Es handelt sich um Makromoleküle mit einer relativ stabilen Konformation und bestimmten biologischen Funktionen.
Formel zur Schätzung des Molekulargewichts: 110*Anzahl der Aminosäuren
Biologische Funktionen von Proteinen
Halten Sie den Flüssigkeitshaushalt aufrecht
Antikörper (Abwehrfunktion)
Liefert Energie, synthetisches Fett und Glukose
Elementarzusammensetzung von Protein
N ist mit durchschnittlich 16 % das charakteristische Element
Proteingehalt = Protein-N-Gehalt / 16 % = Protein-N-Gehalt * 6,25
2. Grundeinheit des Proteins
Strukturformel der Aminosäure
Unterschiede: ① Glycin enthält im Gegensatz zu anderen keine chiralen Kohlenstoffatome
②Prolin ist eine α-Iminosäure und die anderen sind α-Aminosäuren.
Klassifizierung und Struktur von Aminosäuren
Physikochemische Eigenschaften von Aminosäuren
physikalische Eigenschaften
Weiße Kristalle (gelb ist Hydrochlorid)
Löslich in Wasser, verdünnter Säure, verdünntem Alkali, unlöslich in Ethanol und Ether
Ionenkristall, Schmelzpunkt liegt bei 200-300℃
Optische Aktivität: Alle außer Glycin haben chirale Kohlenstoffatome
Optische Eigenschaften
Phenylalanin (Phe)-Absorptionswelle 259 nm
Tyrosin (Tyr) absorbiert Wellen von 278 nm
Tryptophan (Trp) Absorptionswelle 279 nm
Dissoziationseigenschaften und isoelektrische Punkte von Aminosäuren
Der isoelektrische Punkt jeder Aminosäure
chemische Eigenschaften
α-Amino
Formaldehyd
Wenn der Aminosäurelösung überschüssiges Formaldehyd zugesetzt wird, titriert man mit Standard-Natriumhydroxid. Der Titrationsendpunkt ändert sich von pH 12 auf pH 9. Es kann ein Phenolphthalein-Indikator verwendet werden.
Salpetrige Säure (primäre Aminogruppe)
Bestimmung von Aminosäuren nach der Van-Slyke-Methode
Stickstoff stammt zur Hälfte aus Aminosäuren und zur Hälfte aus salpetriger Säure
Iminhaltiges Prolin kann nicht mit salpetriger Säure reagieren
Acylierungsreaktion
Wenn die Aminogruppe einer Aminosäure in einer schwach alkalischen Lösung mit einem Säurechlorid oder Säureanhydrid interagiert, wird die Aminogruppe acyliert. Acylierungsreagenzien werden häufig als Schutzmittel für Aminogruppen verwendet
Dansylchlorid wird zur Markierung der N-terminalen Aminosäuren von Polypeptidketten und zur Quantifizierung von Spurenaminosäuren (Fluoreszenz!) verwendet.
Alkylierungsreaktion
Ein H-Atom der Aminogruppe der Aminosäure kann durch eine Kohlenwasserstoffgruppe (einschließlich zyklischer Kohlenwasserstoffe und deren Derivate) ersetzt werden.
a.sanger-Reaktion: 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB/FDNB) reagiert mit Aminogruppen unter schwach basischen Bedingungen, um DNP-Chlorhydroxysäure (gelbes Öl) zu erzeugen.
b. Edman-Reaktion: Phenylisothiocyanat (PITC) erzeugt PTH unter schwach basischen Bedingungen.
Chiffrierbasis
Die Aminogruppe von Aminosäuren kann mit Aldehyden und Ketonen unter Bildung der Schiffschen Base reagieren
α-Carboxy
Salzbildungsreaktion
Alkalimetallsalze von Aminosäuren sind in Wasser löslich, Schwermetallsalze hingegen sind in Wasser unlöslich.
Reaktion unter Bildung von Säurechlorid
Nachdem die Aminogruppe der Aminosäure geschützt ist, reagiert die Carboxylgruppe mit Dimethylsulfoxid oder Phosphorpentachlorid unter Bildung eines Säurechlorids.
Decarboxylierungsreaktion
Der Prozess der Proteinverrottung findet statt und Aminosäuren werden decarboxyliert, um Amine und Kohlendioxid zu bilden.
α-Amino-α-carboxy
Ninhydrin-Reaktion
Bei der Reaktion entsteht eine blauviolette Substanz, die durch Spektrophotometrie bei 570 nm qualitativ und quantitativ gemessen werden kann;
Prolin und Hydroxyprolin erzeugen direkt ein gelbes Produkt mit einer maximalen Lichtabsorption von 440 nm.
Peptidreaktion
Produkte sind richtungsweisend
Seitenkette
Benzolring
Reagiert mit konzentrierter Salpetersäure unter Bildung einer gelben Substanz
Phenolisch (Tyrosin)
Reagiert mit Salpetersäure und wird rot
Reduzierte Phosphomolybdänsäure und Phosphorwolframsäure zu Molybdänblau und Wolframblau
In Verbindung mit Diazoverbindungen entsteht eine orange-gelbe Substanz
Indolyl (Tryptophan)
Kann unter milden Bedingungen durch Succinimid der N-Generation oxidiert werden
Guanidino (Arginin)
Es reagiert mit α-Naphthol und Hypobromit in alkalischer Lösung und erzeugt eine rote Substanz. Die Reaktion kann in Hydroxylamin-Pufferlösung umgekehrt werden.
Methylthio
Nukleophile Gruppe, bildet mit Alkylierungsreagenzien leicht Sulfoniumsalze
Thiol (Cystein)
Thiol-Anionen entstehen durch Dissoziation bei leicht alkalischem pH-Wert. Die Anionen können schnell mit Alkylhalogeniden wie Jodessigsäure, Jodacetamid, Methyliodid usw. reagieren und entsprechende stabile Alkylderivate erzeugen: Komplex mit Metallionen;
Verwendungsmöglichkeiten von Aminosäuren
Trennung und Analyse von Aminosäuren
Ionenaustauschchromatographie
Die Trenngeschwindigkeit hängt hauptsächlich von der elektrostatischen Anziehung und sekundär von der hydrophoben Wechselwirkung ab
Wenn die polaren Gruppen gleich sind, werden diejenigen mit kleineren Molekulargewichten zuerst ausgewaschen.
Kationenaustauscherharz (sauer): Elutionsreihenfolge sauer > neutral > alkalisch
Anionenaustauscherharz (alkalisch): umgekehrte Elutionsreihenfolge
Elektrophorese
Wenn sich AA am isoelektrischen Punkt befindet, bewegt es sich in einem externen elektrischen Feld nicht.
Wenn der pH-Wert des Mediums unter dem isoelektrischen Punkt von AA liegt, ist AA positiv geladen und bewegt sich im elektrischen Feld zur Kathode.
Im Gegenteil, wenn der pH-Wert des Mediums größer als AA ist
Isoelektrische Niederschlagsmethode
Je näher am isoelektrischen Punkt von AA, desto geringer ist die Löslichkeit von AA und desto leichter fällt es aus.
3. Primärstruktur des Proteins
Primärstruktur
Die Primärstruktur umfasst die Anzahl, Art und Anordnungsreihenfolge der Aminosäuren, aus denen das Protein besteht, die Anzahl der Polypeptidketten sowie die Anzahl und Position der Disulfidbindungen innerhalb oder zwischen Polypeptidketten.
Bestimmung der Primärstruktur
Grundlegende Strategien: Fragmentüberlappungsmethode und direkte Methode zur Bestimmung der Aminosäuresequenz
Die grundlegenden Schritte
① Bestimmen Sie die Anzahl der Polypeptidketten in einem Proteinmolekül
Durch Bestimmung des Verhältnisses zwischen der Molzahl der terminalen Aminosäurereste und der Molzahl des Proteins
② Teilen Sie die Polypeptidkette des Proteins und brechen Sie die Disulfidbindungen zwischen und innerhalb der Polypeptidkette
Nichtkovalente Bindung zwischen Peptidketten: Verwenden Sie 8 mol/L Harnstoff oder 6 mol/L Guanidinhydrochlorid oder hochkonzentrierte Salzsäure unter milden Bedingungen
Kovalente Bindung zwischen Peptidketten: Oxidationsmittel (oxidierende Säure) oder Reduktionsmittel (Sulfhydrylverbindung)
Verwenden Sie ein Alkylierungsreagenz (Jodessigsäure), um -SH auf dem durch Reduktion erzeugten Cysteinrest zu schützen und eine Oxidation zu verhindern
③Analysieren Sie die Aminosäurezusammensetzung jeder Polypeptidkette
④Analysieren Sie die Aminosäuresequenz jeder Polypeptidkette
Bestimmung der N-terminalen Aminosäure
Dinitrofluorbenzol (DNFB/FDNB)
Phenylisothiocyanat (PITC)
Bestimmung der C-terminalen Aminosäure
Carboxypeptidase-Methode
Carboxypeptidase A: hydrolysiert alle C-terminalen Aminosäurereste außer Pro, Arg und Lys
Carboxypeptidase B: kann nur die C-terminalen Aminosäurereste von Arg und Lys hydrolysieren
Carboxypeptidase Gamma: kann auf jede C-terminale Behinderung einwirken
Methoden zur Spaltung von Polypeptidketten
chemische Methode
Bromcyan-Methode
Spaltt gezielt die Peptidbindung, die durch die Carboxylgruppe von Met gebildet wird
Hydroxylamin-Methode
Spaltt gezielt die Peptidbindung zwischen Asn-Gly bei pH=9
Enzymatische Hydrolyse
Trypsin
Die Peptidbindung entsteht nur durch Aufbrechen der Carboxylgruppen von Lys und Arg
Chymotrypsin
Phe, Trp, Tyr (schnelle Hydrolyse)/Leu, Met, His (zweite)
Pepsin
Hydrophobe Aminosäurereste (pH=2)
⑤ Bestimmen Sie die Position, an der Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten gebildet werden
Pepsin wird im Allgemeinen zur Hydrolyse von Proteinen verwendet. Es weist eine geringe Spezifität, viele Trennpunkte, weniger Peptidbindungen mit Disulfidbindungen und einen niedrigen pH-Wert auf, um Austauschreaktionen von Disulfidbindungen zu verhindern.
Diagonale Elektrophorese-Trennung
Isolierung und Reinigung
Trennmethode
Molekülgröße
Zentrifugale Sedimentationsmethode
Die Löslichkeit ist anders
Isoelektrische Niederschlagsmethode
Ladungseigenschaften
Ionenaustauschchromatographie
Adsorptionseigenschaften
Adsorptionschromatographie
Affinitätschromatographie
Ionenaustauschchromatographie
hydrophobe Chromatographie
6. Wichtige Eigenschaften von Protein
Eigenschaften der ampholytischen Dissoziation von Proteinen und elektrophoretische Phänomene
isoelektrischer Punkt des Proteins
Kolloidale Eigenschaften und Niederschlag
Die Partikelgröße der dispergierten Phase liegt zwischen 1 und 100 nm und ist eine kolloidale Lösung.
Drei Bedingungen für Stabilität in wässriger Lösung
Die Partikel der dispergierten Phase liegen im Bereich von 1–100 nm und die Dynamik ist stabil.
Die Proteinoberfläche kann die gleiche Ladung tragen und sich gegenseitig abstoßen, sodass es nicht einfach ist, sich zu großen Partikeln zusammenzuballen und auszufallen.
Oberflächenenergie und Wasser bilden eine Hydratationsschicht, die sich nur schwer aneinander annähern und aggregieren kann.
Niederschlagsmethode
Hochkonzentriertes Neutralsalz (Aussalzen, Salzauflösung)
Natriumchlorid, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat
Säure und Base (isoelektrische Punktfällung)
Ausfällung organischer Lösungsmittel
Ausfällung von Schwermetallsalzen
Verursacht leicht eine Proteindenaturierung
Ausfällung von Alkaloidreagenzien
Verursacht leicht eine Proteindenaturierung
Denaturierungsfällung durch Erhitzen
Unterthema
Das vollständigste und schnellste
Proteinkoagulation
Das Phänomen, bei dem denaturierte Proteine aggregieren oder sich miteinander überschneiden
Es handelt sich im Wesentlichen um ein irreversibles Entwicklungsergebnis nach der Proteindenaturierung.
Denaturierung und Renaturierung
Proteindenaturierung: Physikalische oder chemische Faktoren führen dazu, dass Proteinmoleküle ihre ursprüngliche spezifische räumliche Struktur ändern. Die Peptidkette verändert sich von einer eng geordneten Struktur zu einer lockeren und ungeordneten Struktur, was zu Veränderungen der physikalischen und chemischen Eigenschaften des Proteins führt.
Proteinrenaturierung: Nach der Entfernung denaturierender Faktoren können einige denaturierte Proteine ihre natürliche Konformation und biologische Aktivität wiederherstellen.
denaturierende Faktoren
Chemisch
Säuren, Laugen, organische Lösungsmittel, Proteindenaturierungsmittel (Harnstoff, Guanidinhydrochlorid), Schwermetallsalze
Physik
Erhitzung, ultraviolette Strahlen, Röntgenstrahlen, Ultraschallwellen, heftige Vibrationen
Besonderheit
Die Sekundärbindung wird aufgebrochen, das Konzept wird zerstört, es ist keine kovalente Bindung beteiligt und die Primärstruktur bleibt unverändert.
Verlust oder teilweiser Verlust der Aktivität
Die Löslichkeit nimmt ab und die Viskosität steigt
G
280 nm charakteristische Absorption
Farbreaktion
Coomassie Brilliant Blue G-250
5. Die Beziehung zwischen Proteinstruktur und -funktion
Die komplexe Zusammensetzung und Struktur von Proteinen ist die Grundlage für ihre vielfältigen biologischen Funktionen und die einzigartigen Eigenschaften und Funktionen von Proteinen spiegeln ihre Strukturen wider.
Die Beziehung zwischen Primärstruktur und Funktion
Homologe Proteine: Proteine, die in verschiedenen Organismen die gleichen oder ähnliche Funktionen erfüllen, weisen offensichtliche Ähnlichkeiten in ihren Aminosäuresequenzen auf, d. h. serielle Homologie.
4. Dreidimensionale Struktur des Proteins
Methode zur Bestimmung der dreidimensionalen Proteinstruktur
UV-Differenzspektroskopie
Fluoreszenz und Fluoreszenzpolarisation
Kryo-Elektronenmikroskopie
Kräfte, die die dreidimensionale Struktur von Proteinen stabilisieren
Schwache Wechselwirkung/nichtkovalente Kraft
Wasserstoffverbindung
Der Carbonylsauerstoff und der Amidwasserstoff in der Hauptkette werden zuvor gebildet, was die Hauptkraft zur Stabilisierung der Sekundärstruktur darstellt und einen gerichteten Einschluss und eine gerichtete Sättigung aufweist.
Hydrophobie
Hydrophobe Gruppen oder Seitenketten werden gezwungen, sich anzunähern, da Wasser vermieden werden muss. Die Aggregation hydrophober Gruppen ist ein Ordnungsprozess und die Entropie nimmt ab.
Protein-Sekundärstruktur
Eine regelmäßige Struktur, die dadurch entsteht, dass sich die Polypeptidkette um sich selbst dreht und faltet und durch Wasserstoffbrückenbindungen in der gewünschten Richtung zusammengehalten wird.
enthalten
Alpha-Helix
sich wiederholende Struktur
Die Hauptkraft, die die Helix stabilisiert, ist die Wasserstoffbindung
Innerhalb der Kette bilden sich Wasserstoffbrückenbindungen zwischen -NH und -CO
Die α-Helices in Proteinen sind fast immer rechtsdrehend, haben eine chirale Struktur und sind optisch aktiv
Pro Windung der Helix gibt es 3,6 AA, was einem Anstieg von 0,53 nm entspricht, und jeder Rest ist um 100° gedreht, was einem Anstieg von 0,15 nm entspricht
Ein durch Wasserstoffbrückenbindungen geschlossener Ring ist ein 13-gliedriger Ring, man nennt ihn auch Alpha-Helix
β-Faltblatt
sich wiederholende Struktur
Die Hauptkraft ist die Wasserstoffbrückenbindung
Wasserstoffbrückenbindungen, die von allen -NH- und -CO-Bindungen an benachbarten Peptidrückgraten gebildet werden
Falten Sie das Papier in eine Zickzackform
Parallel und antiparallel
Struktur
Die räumliche Orientierung und Konfigurationsänderungen von Atomen und Gruppen in zusammengesetzten Molekülen beinhalten die Bildung und Zerstörung kovalenter Bindungen, haben jedoch nichts mit Wasserstoffbrückenbindungen zu tun
Konformation
Unterschiedliche räumliche Anordnungen, die durch Rotation entlang kovalenter Einzelbindungen in zusammengesetzten Molekülen entstehen, beinhalten nicht die Bildung und Zerstörung nichtkovalenter Bindungen.
Supersekundärstruktur und Domänen von Proteinen
Supersekundärstruktur
Proteine, insbesondere globuläre Proteinmoleküle, bestehen aus mehreren benachbarten Sekundärstrukturelementen, die miteinander interagieren und eine kleine Vielzahl regelmäßiger Sekundärstrukturkombinationen bilden, die als Tertiärstrukturen in einer Vielzahl von Proteinen dienen
Domain
unabhängige Faltungseinheit des globulären Proteins
Tertiärstruktur von Proteinen
Quartärstruktur von Proteinen
Oligomere Proteine und Untereinheiten
Oligodensin: ein Polymer aus zwei oder mehr kugelförmigen Proteinen, die durch nichtkovalente Bindungen verbunden sind
Untereinheit: Jedes einzelne kugelförmige Protein in einem oligomeren Protein
Quartärstruktur von Proteinen
Arten und Mengen von Untereinheiten sowie die räumliche Anordnung jeder Untereinheit in oligomeren Proteinen und die Wechselwirkungen zwischen Untereinheiten
Vierstufige Strukturmerkmale
Untereinheiten haben keine vollständige biologische Aktivität, wenn sie einzeln vorhanden sind
Untereinheiten sind durch nichtkovalente Bindungen verbunden
Strukturelle und funktionale Überlegenheit
Erhöhte strukturelle Stabilität
Verbesserte genetische Ökonomie und Effizienz
Katalysatoren kommen zusammen
Synergie und allosterische Effekte
Allosterischer Effekt: Ein Ligand, der an einen bestimmten Teil eines Proteinmoleküls gebunden ist, beeinflusst andere Teile
Hauptkraft, die die Proteinstruktur aufrechterhält
Primärstruktur: Peptidbindungen, Disulfidbindungen
Sekundärstruktur: Wasserstoffbrückenbindung
Tertiärstruktur: Wasserstoffbrückenbindung, hydrophobe Wechselwirkung
Quartärstruktur: Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen, Ionenbindungen, Van-der-Waals-Kräfte
Proteinkonzentration messen:
Biuret-Methode, Folin-Phenol-Methode, UV-Absorptionsmethode, Kjeldahl-Methode, Coomassie-Brillantblau-Methode, Ninhydrin-Methode, Bestimmungsmethode für kolloidales Gold
Biuret und Folinphenol erfordern eine intakte Peptidbindung
Ninhydrin benötigt eine Aminosäure-freie Aminogruppe
Die UV-Absorption misst hauptsächlich Tyrosin- und Tryptophan-Rückstände
Kolloidales Gold ist am empfindlichsten
Peptidbindungen und Wasserstoffbrückenbindungen sind die Hauptfaktoren, die die Proteinkonformation bestimmen
Proteinkonformationskrankheiten/Proteindenaturierung
①Der Dünndarm ist der Hauptort der Proteinverdauung
②Die durch Darmbakterien verursachte Zersetzung von unverdautem Protein oder nicht absorbierten Proteinverdauungsprodukten wird als Proteinfäulnis bezeichnet.
③Es gibt sowohl schädliche als auch nützliche Substanzen
Daher kann ein UV-Spektralphotometer zur Bestimmung des Proteingehalts verwendet werden.
Es ist nicht so, dass der Absorptionspeak nur hier auftritt, aber er ist hier stärker
Man kann grob davon ausgehen, dass sie bei 280 nm liegt
Zwischenfall Melamin→Sanlu-Milchpulver
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