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Toxicología 4 Conceptos básicos del experimento de toxicología

Esta imagen presenta los principios y limitaciones de los experimentos toxicológicos, el propósito básico de los experimentos toxicológicos, la selección y manejo de animales de experimentación, los métodos de experimentación con animales, el análisis estadístico de los resultados de los experimentos toxicológicos y el control de calidad de los experimentos toxicológicos. útil para todos.

Editado a las 2024-02-18 11:49:24,

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Toxicología 4 Conceptos básicos del experimento de toxicología

Preguntas de repaso después de clase.

1. ¿Cuáles son las razones de la incertidumbre al extrapolar los resultados de experimentos con animales a los humanos?

2. ¿Qué principios básicos se deben seguir en el diseño de experimentos toxicológicos?

3. ¿Qué cuestiones deben considerarse para determinar si los resultados experimentales tienen importancia biológica?

¿Cuáles son los tipos y propósitos de los experimentos de toxicología?

Experimentos in vitro

Detectar, predecir la toxicidad, explorar mecanismos.

Experimentos in vivo

Evaluación de la toxicidad: animales → humanos

investigación de población

Verificación de los resultados de experimentos con animales.

1. Principios y limitaciones de los experimentos de toxicología.

1. Principios básicos de los experimentos de toxicología.

1. Los efectos en animales de experimentación se pueden extrapolar a los humanos

①La especie animal más sensible son los humanos.

②Los procesos biológicos y el metabolismo químico de humanos y animales de experimentación están relacionados con el peso corporal o la superficie corporal.

Los dos supuestos anteriores son la premisa de toda biología y medicina experimental.

2. Los animales de experimentación deben estar expuestos a dosis elevadas.

Según la definición de respuesta cualitativa, la incidencia de efectos de grupo aumenta al aumentar los niveles de exposición.

Configure 3 o más grupos de dosis y observe la relación dosis-respuesta.

Cuanto mayor sea la distancia entre el LOAEL y la dosis de exposición humana, más seguro será.

3. Los sujetos experimentales son animales adultos sanos.

Los animales adultos sanos sirven como modelos experimentales representativos para la población general, lo que hace que los resultados experimentales sean representativos y reproducibles.

4. La vía de intoxicación es la posible vía de exposición para los seres humanos.

2. Limitaciones de los experimentos de toxicología

La extrapolación de experimentos con animales a humanos es incierta

Existe incertidumbre al extrapolar dosis altas a dosis bajas

La extrapolación de un pequeño número de animales a un gran número de personas es incierta

Generalmente se utilizan animales adultos sanos y la reacción es relativamente sencilla.

3. Principios de las “3R” y ética de los experimentos con animales

Principio "3R"

reemplazo

Un método científico que utiliza experimentos u otras investigaciones realizadas con métodos distintos a los animales para lograr un propósito experimental, o que utiliza materiales experimentales no sensibles en lugar de animales vertebrados conscientes para experimentos.

reducción

Un método para obtener la misma cantidad de datos experimentales con menos animales o para obtener más datos experimentales con un cierto número de animales.

Refinamiento

Métodos que mejoran y perfeccionan los procedimientos experimentales para aliviar o reducir el dolor y el malestar de los animales y proporcionar bienestar animal.

Cuestiones éticas en la experimentación con animales.

ley

"Ley Martin", "Reglamento sobre la administración de animales de laboratorio"

respetar los principios

Proporcionar un manejo y trato humano a los animales de experimentación; minimizar el dolor y la incomodidad de los animales de experimentación;

Principios éticos de la experimentación humana

principio de consentimiento informado

Principio de beneficio sin daño

principio de propósito médico

principio científico

principio de control experimental

2. Propósitos básicos de los experimentos de toxicología.

El propósito básico de la evaluación de seguridad.

Observe los efectos tóxicos y las propiedades de la sustancia de prueba.

Estudios de relación dosis-respuesta (efecto)

Determinar los órganos diana de la toxicidad.

Determinar la reversibilidad del daño.

Otros propósitos de los experimentos de toxicología.

Indicadores de detección sensibles para efectos tóxicos.

marcadores biológicos

mecanismo de envenenamiento

Toxicocinética de las sustancias de prueba.

Metabolismo de la sustancia problema y medidas de rescate en caso de intoxicación.

3. Selección y manejo de animales de experimentación.

animales de laboratorio

Animales que han sido criados artificialmente, y los microorganismos que portan están controlados, con antecedentes genéticos claros y origen claro. Se utiliza principalmente para la investigación científica, la evaluación de la eficacia y seguridad de medicamentos y productos biológicos y la enseñanza.

Selección de especies animales de experimentación.

Generalmente elige dos especies: roedores y no roedores.

El principio básico

① Las características metabólicas, bioquímicas y toxicológicas son similares a las de los humanos.

②Vida natural más corta

③Fácil de administrar y operar

④Económico y fácil de conseguir

Selección de cepas de animales experimentales.

Cepa: Término propio de la zoología experimental, que se refiere a un grupo de animales derivados del mismo ancestro mediante métodos de apareamiento planificados, o animales, plantas o microorganismos derivados del mismo ancestro y que tienen un genotipo específico.

Animales de experimentación clasificados por control genético.

innato

Una raza pura de animal criada mediante apareamiento continuo entre hermanos o padres e hijos durante más de veinte generaciones. Por ejemplo, los ratones tienen BALB/C, Jinbai I, Jinbai II, etc.

Animales del grupo híbrido (cruce de 1 generación, F1)

La primera generación de animales resultante del cruce intencionado de dos cepas endogámicas diferentes. Hay una clara heredabilidad y vigor híbrido.

grupo cerrado

Una población es un grupo de animales que no introduce sangre nueva del exterior durante más de 5 años, y es sólo un grupo de animales de la misma cepa que se aparean aleatoriamente y se reproducen en un lugar fijo. Como ratones Kunming, ratones NIH, ratas Wistar, etc. Más utilizado en la investigación de toxicología.

Parámetros de control microbiológico para animales de experimentación.

Animal Convencional (CVA)

Animal Limpio (CLA)

En las pruebas de toxicidad y estudios toxicológicos, se deben utilizar animales CLA o superiores para garantizar la confiabilidad de los resultados experimentales.

Animal libre de patógenos específicos (SPF)

Animal libre de gérmenes (GFA)

Estándares de grado microbiano para animales de laboratorio

Nivel I: CVA, sistema abierto, sin enfermedades transmisibles que puedan transmitirse a los humanos.

Nivel II: CLA, sistema de barrera, además de los estándares de Nivel I, la línea de especies es clara y no existen enfermedades infecciosas específicas del animal.

Nivel III: SPF, sistema de barrera o aislamiento, además de los estándares de Nivel II, criados según los requisitos de línea pura, criados en un aislador o sala de flujo laminar, pueden tener colonias bacterianas no patógenas y sin patógenos patógenos.

Nivel IV: GFA, sistema de aislamiento, animales puros criados en condiciones estériles completamente cerradas, sin microorganismos ni parásitos (incluida la mayoría de los virus) ajenos a los animales.

Selección individual de animales de experimentación.

género

edad y peso

Estado fisiológico

Estado de salud

Estructura de las instalaciones para animales de laboratorio

Área de recepción y cuarentena de animales

Área de alimentación y experimentación animal.

Área de almacenamiento de alimentos, ropa de cama y suministros.

Área de lavado y desinfección

Área de almacenamiento y procesamiento de residuos

área de gestión

Tipos de instalaciones para animales de experimentación

sistema abierto: ambiente ordinario

Sistema de barrera: Limpieza clase 10.000.

Sistema de aislamiento: Nivel de limpieza 100

4. Métodos de experimentación con animales

Principios de diseño de experimentos con animales

principio de aleatorización

Completamente aleatorizado (diseño de factor único)

Aleatorización estratificada (diseño de emparejamiento)

Principio de contraste

Controles comunes para las pruebas de toxicología

Control no tratado (control en blanco)

Sin factores de procesamiento, sin sustancias de prueba, sin operaciones

Determinar el valor de fondo de las características biológicas, control de calidad.

Control negativo (control de disolventes)

No hay factores de procesamiento, se proporcionan los factores experimentales necesarios (disolventes) y se elimina la influencia de los factores experimentales (disolventes).

control positivo

Utilice positivos conocidos para probar la eficacia del sistema experimental.

Las pruebas de toxicología genética, las pruebas de teratogenicidad y las pruebas de carcinogenicidad tienen grupos de control positivos.

autocontrol

Se compararon los mismos sujetos de investigación antes y después del tratamiento. Por ejemplo, observe los cambios en la presión arterial antes y después de tomar el medicamento.

Se requiere que las condiciones experimentales antes y después del tratamiento del factor de investigación sean consistentes y que los parámetros observados sean estables.

Comparación histórica

Consiste en datos del grupo de control de múltiples experimentos pasados en el mismo laboratorio.

Verificar la estabilidad del sistema experimental mediante pruebas de homogeneidad para controlar y asegurar la calidad del laboratorio.

Principio de repetición

Repetición de todo el experimento.

Garantizar la reproducibilidad de los resultados experimentales.

Observaciones repetidas de múltiples sujetos.

Debe haber un tamaño de muestra suficiente para cada grupo.

Puntos clave del diseño de experimentos con animales.

Agrupación de dosis para pruebas de toxicología in vivo

Número de animales en cada grupo.

Período de prueba

Preparación antes de experimentos con animales.

Después de comprar animales de experimentación, los machos y las hembras deben mantenerse por separado.

Generalmente la cuarentena se realiza durante 5 a 7 días.

Identificación de género de animales de experimentación de uso común.

Preparación antes de la exposición al veneno.

Agrupación de animales

Pesaje, numeración, agrupación aleatoria.

Preparación de la sustancia de prueba.

Agrupación de dosis, volumen de exposición, dilución.

Elección de la ruta de exposición.

Tracto gastrointestinal, tracto respiratorio, piel, subcutáneo, intradérmico, músculo, cavidad abdominal, vena.

Preparación de la sustancia problema

Preparaciones de veneno

Formas de dosificación comunes: solución acuosa, suspensión, solución oleosa.

Las sustancias de prueba solubles en agua permanecen consistentes con la presión osmótica en el cuerpo.

Sustancia problema insoluble en agua, disuelta o suspendida en un disolvente orgánico apropiado

Por lo general, la sustancia problema debe prepararse fresca antes de su uso.

Puntos clave en la preparación de preparaciones venenosas.

Al prepararlo, no caliente el objeto de prueba a una temperatura que pueda cambiar sus propiedades físicas y químicas.

Para evaluar la toxicidad cutánea de sustancias de prueba sólidas, se deben mantener su forma y tamaño de partícula.

Prepare la sustancia problema multicomponente según la fórmula para que la preparación refleje exactamente la mezcla original.

Los preparados deben mantener la estabilidad química y la coherencia con la sustancia problema.

La preparación debe reducir el volumen total de prueba y no utilizar demasiado disolvente o excipiente.

Los preparativos deben ser fáciles de preparar para la exposición.

El pH de la preparación es mejor entre 5 y 9.

No utilice ácidos o bases para disociar la sustancia de prueba.

En caso de intoxicación parenteral, la solución final debe ser lo más isotónica posible.

Rutas de exposición a animales de experimentación.

Exposición oral (gastrointestinal)

Tragar cápsulas

alimentar

Administracion oral

Infección a través del tracto respiratorio.

Investigación sobre venenos químicos existentes en forma de gas, vapor, polvo, humo, niebla, etc. en condiciones de producción y evaluación de contaminantes atmosféricos ambientales.

Exposición por inhalación: estática y dinámica.

Inyección intratraqueal: realizada después de la anestesia.

exposición de la piel

Venenos químicos en estado líquido, gaseoso o incluso polvoriento.

La mayoría elige conejos y cobayas. Se depila la piel de ambos lados de la columna vertebral del animal, se aplica el veneno químico localmente y se cubre y fija con una campana de vidrio, papel engrasado o película plástica durante un período determinado. tiempo.

Pesticidas, cosméticos, contaminantes ambientales, medicamentos tópicos.

Ratas de uso común

Formas de exposición

Depilación: depilación química o mecánica

Exposición al veneno: aplicación local o método de inmersión de la cola.

Exposición mediante inyección

inyección intraperitoneal

Inyección intravenosa

inyección intramuscular

inyección subcutánea

Colección de muestras biológicas.

Recolección de orina y heces.

Colección de muestras de órganos

colección de bilis

recogida de sangre

fin

Extracción de sangre no terminal

El volumen de extracción de sangre única es inferior al 15 % del volumen de sangre total del animal y no afectará al animal.

Los efectos secundarios ocurrirán cuando el volumen de sangre sea del 15% al 20% del volumen sanguíneo total.

Las extracciones de sangre múltiples cada 24 horas no deben exceder el 1% del volumen sanguíneo total.

anestesia

Anestesia general (pentobarbital sódico) y local (procaína, etc.)

eutanasia

El proceso de matar animales utilizando métodos humanos y públicamente reconocidos para que mueran pacíficamente y sin dolor, sin miedo ni ansiedad.

Anatomía patológica y recogida de muestras.

El examen patológico es una parte importante de las pruebas toxicológicas y los estudios patológicos pueden ayudar a determinar los efectos nocivos y los órganos diana. El examen patológico incluye anatomía macroscópica y examen histopatológico.

Anatomia asquerosa

Media hora después del sacrificio de los animales de experimentación, se diseccionaron mediante el método combinado de extracción de órganos torácicos y abdominales.

Observe la forma, condición de la superficie, color, borde, tamaño, textura y sección de los órganos relevantes.

Pese los órganos designados y calcule los coeficientes de los órganos.

Procedimientos operativos estándar para la anatomía patológica de animales de laboratorio.

1. Fijar el animal en la tabla de disección y diseccionar el cuello (glándula parótida, ganglios linfáticos, etc.)

2. Tome un lado de la piel del pecho y la cintura, abra el abdomen y expanda la incisión (órganos abdominales internos)

3. Toracotomía (órganos internos del tórax, lengua y garganta, tráquea, glándula tiroides, etc.)

4. Retire la extremidad trasera izquierda (músculos, etc.), el cuero cabelludo y las orejas, abra el cráneo y exponga la médula espinal.

Examen histopatológico

Utilice un cuchillo afilado para cortar el órgano o tejido designado y unificar las partes.

Los bloques de tejido generalmente se fijan en 10 veces el volumen de una solución de formaldehído al 10% y luego se preparan de manera rutinaria (inclusión de tejido en parafina, corte y tinción con HE).

Observar y registrar al microscopio para realizar diagnóstico patológico.

5. Análisis estadístico de los resultados de experimentos de toxicología.

Análisis estadístico de resultados.

Comparación por pares entre cada grupo de tratamiento y el grupo de control negativo y comparación entre múltiples grupos de tratamiento y el grupo de control negativo

relación dosis-respuesta y relación dosis-respuesta

tabla de control de calidad

Preguntas que deben responderse al evaluar los resultados de las pruebas de toxicología

¿Es estadísticamente significativo?

¿Es biológicamente significativo?

Si tiene importancia toxicológica, es decir, si tiene efectos nocivos.

Cuestiones a considerar al determinar la importancia biológica

Comparación longitudinal: si existe relación dosis-respuesta para cambios en este parámetro.

Comparación horizontal: si los cambios en este parámetro van acompañados de cambios en otros indicadores relacionados.

La diferencia entre las medias del grupo de tratamiento y el grupo de control es más del doble del error de detección.

Cuestiones a considerar al determinar la importancia biológica

Comparación con controles históricos: El valor normal de referencia de animales de experimentación se compone de los resultados del control negativo de al menos 10 experimentos independientes realizados recientemente en este laboratorio utilizando la misma cepa de animales de experimentación y el mismo disolvente, y su media ±1,96 × estándar. El error se utiliza como rango de valores de referencia. Los controles negativos deben estar dentro de ±3 veces el error estándar de la media de los controles históricos.

Si se compara un determinado valor observado en el grupo de tratamiento con el grupo de control, la diferencia es estadísticamente significativa, y si cumple una de las siguientes condiciones, se puede considerar que ha excedido el rango de valores de referencia normal y es un efecto nocivo.

①El valor excede el rango de valores de referencia normal

②El valor está dentro del rango de valores de referencia normal, pero la diferencia continúa durante un período de tiempo después de detener el contacto.

③El valor está dentro del rango de valores de referencia normal, pero si el cuerpo se encuentra en un estado de estrés funcional o bioquímico, la diferencia será más obvia.

Importancia estadística y importancia biológica de los resultados de las pruebas toxicológicas.

6. Control de calidad de los experimentos de toxicología.

Buenas prácticas de laboratorio (BPL)

Es un reglamento de gestión formulado para la evaluación de la toxicidad de medicamentos, aditivos alimentarios, pesticidas, cosméticos y otros artículos médicos.

Es un documento normativo que regula un sistema completo de gestión organizacional para investigaciones de seguridad no clínicas relacionadas con la salud humana y el medio ambiente, incluida la planificación, implementación, supervisión, registros y gestión de archivos experimentales.

La historia del desarrollo de GLP en el país y en el extranjero.

Los países desarrollados comenzaron a desarrollar e implementar formalmente las BPL en las décadas de 1960 y 1970.

Los países que han implementado sistemas GLP incluyen Estados Unidos, Japón, Reino Unido, Alemania, Países Bajos, Suecia y Suiza.

A finales de la década de 1980, mi país llevó a cabo sucesivamente trabajos de investigación e implementación de BPL en medicamentos y otros productos y venenos relacionados.

Propósito y significado

Dirigido a organizar y gestionar las actividades de investigación del personal científico y tecnológico.

Promover a los investigadores para mejorar la calidad y validez de los datos experimentales.

Promover el reconocimiento mutuo de datos experimentales a nivel internacional.

Evite la duplicación innecesaria de experimentos y reduzca el desperdicio de recursos.

Garantizar la confiabilidad, integridad y repetibilidad de los resultados experimentales.

Contenidos fundamentales

Requisitos para organizaciones y personal.

Requisitos para instalaciones, instrumentos, equipos y materiales experimentales.

Procedimientos operativos estándar (POE)

Requisitos para el proceso de implementación del trabajo de investigación.

Requisitos para los archivos y su gestión.

Certificación de calificación de laboratorio y supervisión e inspección.

Procedimientos operativos estándar SOP

El objetivo es garantizar la reproducibilidad operativa y la credibilidad de los resultados.

Cuando el personal que ha recibido educación y capacitación realiza pruebas de acuerdo con los SOP, la reproducibilidad de sus operaciones de prueba y de los resultados de operación es mejor.

En la misma institución de investigación o laboratorio, si diferentes personas realizan operaciones y pruebas de acuerdo con los SOP, se pueden garantizar resultados más consistentes.

sistema organizacional

Unidad de Garantía de Calidad (QAU—Unidad de Garantía de Calidad)

QAU se refiere al departamento u organización dentro de la agencia de inspección responsable de garantizar que su trabajo cumpla con las especificaciones GLP.

QAU es la clave para la construcción GLP. Tener un buen plan experimental y POE para diversas operaciones específicas no necesariamente garantiza resultados de prueba de alta calidad.

Líder del proyecto (Director del Estudio SD)

Se refiere a la persona responsable de organizar y ejecutar un determinado trabajo de investigación o inspección. SD es la figura central de la gestión organizativa específica en la agencia de inspección. Poseer una amplia estructura de conocimientos y una rica experiencia laboral. El cultivo y la calidad de SD son cruciales para los laboratorios GLP.

Control de calidad del diseño experimental de toxicología.

Puntos clave en el diseño de experimentos de toxicología in vivo.

Agrupación de dosis para pruebas de toxicología in vivo

Número de animales en cada grupo.

Período de prueba

Diseño de pruebas de toxicología in vitro.

Probar la solubilidad de la sustancia problema.

Recomendación de la dosis más alta a probar (10 mmol/L o 5 mg/ml)

Activación metabólica (homogenado de hígado de rata adulta macho pretratado con PCB 1254, 90000 g de sobrenadante centrífugo (S9) y sistema de regeneración de NADPH)

Control de calidad durante la implementación de experimentos de toxicología.

Procedimientos operativos y gestión del laboratorio.

Gestión de reactivos

Gestión de instrumentos

gestión ambiental

Manejo de animales de laboratorio

Manejo de ciegos

tabla de control de calidad

Control de calidad del análisis de los resultados de experimentos toxicológicos.

Análisis estadístico de datos experimentales.

Evaluación de resultados experimentales.

Preguntas para pensar

Dado que las pruebas de toxicidad crónica tienen un ciclo largo, consumen muchos animales y requieren mucha mano de obra y recursos materiales, ¿cómo garantizar la confiabilidad de las pruebas crónicas con animales?

El control de calidad del laboratorio es un requisito previo para garantizar el éxito de la prueba y la cientificidad y precisión de los datos experimentales.

Las pruebas de toxicidad crónica deben realizarse de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL).

Incluyendo diseño experimental razonable, selección y manejo de animales, preparación y manejo de sustancias de prueba, operación experimental y control de las condiciones de prueba.